关于全长转录组的8个问题，你都问对了吗？
随着三代测序技术的不断成熟，
全长转录组受到越来越多的科研工作者的认可。
新发表的文章一篇接一篇，
特别是玉米和高粱的全长转录组文章，
同时发表在Nature Communications杂志，
引起了科研界的轰动。
那全长转录组产品究竟是何方圣神，
为啥这么厉害？
科技君将推出全长转录组基础知识及应用案例的专题介绍,
希望可以给爱学习的您带来一些帮助。
今天第一期将为大家带来“全长转录组”知识大放送，
不仅仅有常见问题的回答，
还有全长转录组的文献列表，
赶紧学起来吧！
1为什么要做全长转录组测序？
转录本是非常多样和复杂的，绝大多数的基因，不符合一基因一转录本的模式，这些基因往往存在多种剪切形式。通过二代测序，我们可以很准确地进行基因的表达及定量的研究，但是受限于读长的限制，不能得到全长转录本的信息。2013年， Nature Methods 杂志做过一个很形象的比喻，通常转录组测序是首先把RNA打成片断，然后再把它们拼接回原来的样子。基于二代的测序的研究流程，见图1。
图1 转录组研究现状
基于二代测序平台的转录组产品，是首先把RNA打成小的片断进行测序，然后再通过生物信息的方法进行拼接，然后交付给客户。但是基于二代测序平台的转录组，由于读长的限制（PE150），在转录本组装的过程中存在较多的嵌合体，并且不能准确地得到完整转录本的信息，从而对后面的表达量分析、可变剪接、基因融合等分析造成了较大的影响。（图片来自：Genomics:the state of the art in RNA-seq analysis）
目前基于PacBio的单分子实时测序技术，目前平均读长已经达到10Kb以上，最长可达40Kb，转录组测序不再需要组装，就可以直接得到全长转录本的信息。
2三代全长转录组实验流程？
全长cDNA合成：使用Clontech SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit合成全长的cDNA。
片段选择及PCR扩增：采用BluePippinTM仪器进行片段选择，片段的大小为 1~2 kb, 2~3 kb, 3~6 kb, 5~ 10 kb。
SMRTbell文库制备：将不同插入片段cDNA加上SMRTbell接头，并完成文库构建。
测序：文库进行质控后上机测序。
图2 三代全长转录组实验技术流程
3全长转录组测序为什么要建3-4个文库？
如果只构建1个文库，而文库的片段范围是1-10K的话，上机数据会有大部分都是小片段的，大片段的转录本所占的比例会非常少，这是因为小片段更利于掉入ZMW小孔中，所以为了得到更全面的转录本的信息，推荐分梯度构建3-4个文库。
4全长转录组产品的适用范围？
5全长转录组的方案推荐？
对于无参考序列物种或者参考序列不完整的物种：可以将不同组织或不同发育阶段样本等量混合RNA做全长转录组测序，这样可以得到该物种的转录本集合，然后结合二代测序，进行基因表达定量及差异分析。这样相对于传统的二代测序进行转录组de novo测序做参考序列来说，结果更准确；
对于有参考序列物种：可以通过三代全长转录组测序得到该物种的Isoform集合，然后比对到该物种的参考基因组序列，从而检测可变剪接、基因融合、lncRNA。
6全长转录组推荐的测序数据量？
对于全长转录组的测序，数据量并不是固定的，当然数据量越多，检测到的全长转录本也会越全。根据PacBio测序原理及转录本的长度分布，我们推荐性价比较高的两个方案。
7全长转录组测序可以研究lncRNA吗？
可以的，全长转录组是采用SMART的实验技术，可以对含有polyA的RNA序列进行扩增， 所以可以提供含有polyA的lncRNA的信息。
8可以提供全长转录组文献列表吗？
由于篇幅有限，今天的分享到此为止。如果您有任何疑问，欢迎留言给科技君，或咨询当地科技代表，当然也可以通过如下方式联系我们：
电话：400-706-6615
邮箱：info@bgitechsolutions.com
网站：www.bgitechsolutions.com
地址：深圳市盐田区洪安三街21号华大综合园7栋，518083
*最终解释权归深圳华大基因股份有限公司所有。
预告
科技君在接下来的微信文章中，将为大家分享几篇最新的全长转录组应用文章，敬请关注！
撰稿：王 艳
编辑：市场部
猜你喜欢
请继续关注“BGI华大科技”公众号，
科技君将一如既往地为您提供精彩内容！
如有相关问题，欢迎后台留言~~
▼
关注华大科技，尽享精彩科研！